O primeiro confronto definido foi do Cruzeiro, maior campeão da história da Copa do Brasil com seis títulos, que enfrentará o Sousa-PB na cidade sede do clube paraibano. Segundo o regulamento do torneio, os times mais bem colocados no Ranking Nacional de Clubes (RNC) iniciarão as partidas fora de casa, porém terão a vantagem do empate para avançar à próxima fase. Além do Cruzeiro, equipes como Corinthians, Fortaleza e Bahia terão que buscar a classificação fora de seus domínios.
Dentre os estreantes na competição, está o Audax-Rio, de Angra dos Reis (RJ), que fará sua estreia enfrentando a Portuguesa-RJ. Além disso, haverá um clássico tocantinense entre Capital e Tocantinópolis, ambos estreantes na Copa do Brasil. Os outros clubes que participarão pela primeira vez do torneio são Água Santa, Amazonas-AM, Manauara-AM, Olaria-RJ, Grêmio Atlético Sampaio-RR, Itabuna-BA e Petrolina-PE.
Os dois vencedores de cada grupo na primeira fase avançarão para a etapa seguinte, que também será eliminatória e realizada em jogo único. Em caso de empate, a definição ocorrerá através de cobranças de pênaltis. A partir da terceira fase, se juntarão os times classificados e mais dois clubes: Palmeiras, Grêmio, Atlético-MG, Flamengo, Fluminense, São Paulo, Botafogo e RB Bragantino, que serão os representantes brasileiros na Copa Libertadores, além de Athletico-PR (nono colocado na Série A do Brasileirão 2023), Ceará (campeão da Copa do Nordeste), Goiás (campeão da Copa Verde) e Vitória (campeão da Série B).
